【IF 12.8】江苏省人民医院徐卫教授与世和基因合作：脑脊液ctDNA精准预测初诊DLBCL中枢受累风险

中枢神经系统受累（CNSi）是系统性弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中罕见但严重的不良事件，约5%的患者在初治期间或之后不久会发生中枢复发，预后较差^[1]。目前常规诊断手段对继发性中枢淋巴瘤（SCNSL）的检测灵敏度有限，且现有预测模型（如CNS-IPI）的特异性不高。脑脊液循环肿瘤DNA（CSF-ctDNA）作为液体活检媒介在中枢淋巴瘤诊断中具有重要价值^[2]，但尚未有研究报道其在初诊DLBCL患者中预测中枢受累风险的应用。

江苏省人民医院徐卫教授团队与世和基因合作，采用血默胜D™对100例初诊DLBCL患者的组织、血浆和脑脊液样本进行检测，并前瞻性纳入26例患者进行验证。研究发现约四分之一的DLBCL患者初诊时CSF-ctDNA阳性，且阳性结果与中枢受累风险增加及预后不佳相关。同时，研究通过组织全转录组测序（RNAseq）揭示了DLBCL中枢受累潜在生物学机制。相关研究成果已刊登于国际知名血液学期刊Leukemia（IF=12.8）^[3]。

研究亮点

1、在较大队列中首次揭示初诊DLBCL（ND-DLBCL）治疗前CSF(+)人群的比例，遗传特征。研究结果表明CSF-ctDNA检测比临床常规检测方法的灵敏度更高。

2、CSF(+) DLBCL与原发中枢神经系统淋巴瘤(PCNSL)具有不同的基因组特征。

3、与CNS-IPI相比，初诊DLBCL检测到CSF(+)预测中枢复发的敏感度和特异性更高，而治疗过程中CSF-ctDNA动态监测能够提示治疗响应和肿瘤复发。

4、探究了与CSF(+)相关的临床、生物学和遗传因素，首次阐述了ND-DLBCL中促进早期CNS受累的潜在机制。

研究内容

研究队列：该研究纳入2021年12月-2023年4月共100例ND-DLBCL患者作为训练队列，并前瞻性纳入2023年5月-2023年6月的26例ND-DLBCL患者作为验证队列；另纳入独立的24例ND-PCNSL患者用来比较基因组差异。所有ND-DLBCL患者的一线治疗均为R-CHOP样方案或R-CGVP方案，CNS预防策略参考NCCN指南。

样本采集：样本采集信息和不同队列的样本分析情况如图1所示。所有脑脊液样本均提交常规检测、生化、形态学和流式细胞术检查。

CSF-ctDNA阳性【CSF(+)】判断标准：（1）如果送检基线组织，脑脊液至少检出一个与组织一致的突变；（2）未送检基线组织，脑脊液至少检出一个既往研究报道DLBCL中典型的驱动突变。目前临床中枢受累的常规诊断方法包括典型症状、影像学表现和/或脑脊液淋巴瘤细胞学诊断。

图1. 不同队列的样本采集类型、采集时间点和样本数量

研究结果

训练队列和验证队列中分别有25%（25/100）和27%（7/26）的患者初诊时CSF(+)，然而在训练队列中使用临床常规方法仅检出3例（3%）阳性，这3例均为CSF(+)（图2A、B）。CSF(+)患者的脑脊液突变检出与外周组织具有较高的一致性，这表明早期中枢神经系统浸润没有发生克隆进化，其中突变频率最高的5个基因是PIM1、MYD88、CD79B、BTG1和BTG2，都属于MCD亚型的典型突变特征（图2A、C）。

图2. ND-DLBCL初诊时CSF-ctDNA(+)比例、突变特征与CSF-ctDNA浓度分析

由于CSF(+)患者的Top突变基因以MCD亚型特征为主，最新的WHO分类指出PCNSL分子分型主要是MCD亚型，是否提示这两类患者具有相同的遗传学特征和发生发展机制呢？接下来，研究探索了CSF(+)与PCNSL的分子分型、突变谱特征、CSF-cfDNA的片段化特征和表达谱的差异。分子分型结果表明，75%的PCNSL患者属于MCD亚型，而CSF(+)患者只有44%属于MCD亚型（图3A）；且CSF(+)患者CSF-ctDNA浓度显著低于PCNSL，可能提示存在无法通过传统方法检测到的继发中枢受累早期阶段（图3B）。此外，这两类患者组织和脑脊液中的突变谱特征也存在较大差异，MYD88、BCL2、PIM1、IRF4、PRDM1等一些突变在PCNSL中的频率显著更高，其他一些突变如PLCG2、MEF2B仅在CSF(+)中检出（图3C、D）。

图3. CSF(+)ND-DLBCL与PCNSL具有不同的遗传特征

在诱导治疗结束时（EOT），33.33% （24/72）的患者血浆ctDNA阳性（MRD^end+），CSF(+)与MRD^end+显著相关，CSF(+)组EOT时血浆ctDNA未清零的比例更高（图4A、B）。此外，CSF(+)与更差的PFS（p=0.012）和OS显著相关（p=0.028）（图4C、D）。为验证传统预防治疗是否可以清除CSF(+)患者的CSF-ctDNA负荷，研究评估了EOT或疾病进展的任何时间收集的CSF样本。从25例CSF(+)患者中获得16例EOT时CSF样本，其中10例患者在治疗结束时CSF-ctDNA清零。这10例患者中，9例末次随访时仍保持CSF-ctDNA清零（图4E），1例进展为实体CNS肿瘤（图4G）。

值得一提的是，在EOT时达到CSF-ctDNA阴性的10例患者中，4例没有接受特殊CNS治疗也实现了CSF-ctDNA清零（图4E、G）；25例CSF(+)患者中，3例最终经影像学证实实体病变（CNS复发）（图4G-J）；75例CSF(-)患者直到末次随访也没有被诊断为CNS病变。因此，CSF(+)预测CNS复发的敏感性为100%，特异性为77.3%。然而，3例CNS复发患者中只有1例为CNS-IPI高危，这提示高危CNS-IPI预测CNS复发的敏感性仅为33.3%（图4F）。

图4. CSF-ctDNA动态监测提示疗效和复发

单因素分析发现，较高的基线血浆ctDNA浓度和CSF蛋白与CSF(+)显著相关（图5A、B）。此外，CSF(+)与高危CNSi部位（包括乳腺、肾/肾上腺和睾丸）的受累显著相关，而CSF(-)与原发性胃肠道受累相关（图5C），与其他两个高危部位相比，肾/肾上腺部位是CSF(+)的强预测因子（图5D）。

多因素分析确定了CSF(+)的三个独立预测因素：高CSF蛋白水平、高血浆ctDNA负荷和高危CNSi部位（图5E）。为探索CSF(+)相关驱动突变，研究比较了CSF(+)和CSF(-)患者组织中的基因突变谱差异（图5F），结果表明在MCD亚组中，CARD11(p=0.048)突变与CSF(+)显著相关，而KLF2 (p=0.067)和MGA突变(p=0.080)也与CSF(+)有显著相关的趋势（图5G）；但在非MCD亚组中，PLCG2 (p=0.040)和JAK2突变(p=0.040)与CSF(+)显著相关，FAT4突变(p=0.023)与CSF(+)呈负相关（图5H）。

图5. CSF(+)相关的临床和遗传因素分析

为了探索ND-DLBCL中枢侵犯的内在机理，研究比较了CSF(+)和CSF(-)患者肿瘤样本之间的转录组差异。CSF(+)DLBCL患者的下调基因显著聚集于多个关键通路，如PI3K-AKT信号通路、局灶黏附、紧密连接、癌内通路、肌动蛋白细胞骨架调控以及细胞黏附分子等。亚组分析发现，在高ctDNA负荷、CARD11突变和FAT4野生的情况下会有类似通路富集，而在MCD亚组和CNSi高危部位亚组中，并未发现类似的趋势，这可能意味着这两类特殊人群在发生早期CNS受累时，依赖不同的分子机制（图6A）。图6B展示了这六种通路中的主要基因，供未来更详细的机制研究使用。

图6. CSF(+)与CSF(-)患者组织转录组分析

结   语

本研究首次揭示了脑脊液ctDNA检测在ND-DLBCL中的应用潜力，包括其基线检出率以及CSF(+)人群的基因组和转录组特征。研究强调，作为一种非侵入性生物标志物，初诊时CSF(+)是中枢受累的高危风险因素，其预测中枢受累的灵敏度和特异性较CNS-IPI模型更胜一筹。同时研究还发现，CSF(+)与预后不良显著相关，突显了脑脊液ctDNA检测在预测CNS复发和预后分层中的关键作用。这一发现有望为未来ND-DLBCL中枢神经系统预防/治疗临床标准流程提供有益的补充。

参考文献