导语
结外NK/T细胞淋巴瘤（ENKTL）是非霍奇金淋巴瘤（NHL）的一种独特亚型，异质性高且侵袭性强，超过80%的ENKTL是鼻型，具有明显的地域差异，亚洲人群发病率明显高于欧洲和北美人群。在我国，ENKTL是最常见的T/NK细胞淋巴瘤亚型，以培门冬酶为基础的化疗标准方案治疗播散性ENKTL，5年总生存期率（OS）仅为10-40%，对含培门冬酶的化疗方案耐药的患者会迅速出现疾病进展且预后较差[1]。因此，迫切需要建立ENKTL细胞系模型，探索培门冬酶的耐药机制，并寻找新的靶向药物来改善预后。
江苏省人民医院徐卫教授团队与世和基因合作，构建了国内首个复发难治（R/R）鼻型ENKTL细胞系（NK-NJ）模型，使用世和基因血默胜™大Panel、全外显子测序（WES）和全转录组测序（RNA-seq）技术全面揭示疾病进展时的克隆演化机制，以及NK-NJ细胞系的基因组特征和EBV潜伏感染模式。此外，基于NK-NJ细胞系的潜在药物分析发现，XPO1抑制剂及阿扎胞苷联合PD-1抑制剂可能是进展期或R/R ENKTL患者潜在的获益药物。该研究成果已于近期发表在Human Cell（IF=4.374）。
专家简介
徐卫 教授
南京医科大学第一附属医院（江苏省人民医院）
血液科副主任、主任医师、博士生导师
中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会副主委，淋巴瘤学组组长
中国老年保健协会淋巴瘤专业委员会副主委
中国医药教育协会淋巴瘤分会副主委
CSCO中国抗淋巴瘤联盟常委
中国老年医学学会血液学分会常委
中国女医师协会血液专业委员会常委
中国老年肿瘤学会淋巴血液肿瘤专业委员会常委
中国抗癌协会淋巴瘤专业委员会委员
中国病理生理学会实验血液学专业委员会委员
中国医师协会整合医学医师分会整合血液病学专业委员会委员兼秘书等
研究结果
国内首个R/R ENKTL患者来源的NK细胞系（NK-NJ）模型
患者，男，52岁。
2020年9月，通过鼻活检诊断为ENKTL，接受6周期的P-GemDOx方案（培门冬酶、吉西他滨、地塞米松、奥沙利铂）及鼻部放疗获得完全缓解（CR）。
2021年8月，出现腹痛腹胀，通过右侧腹股沟淋巴结活检再次诊断为ENKTL，并接受一个周期的PEMD方案（培门冬酶、依托泊苷、甲氨蝶呤、地塞米松）治疗。
2周内，患者外周血中检出肿瘤细胞，治疗方案调整为信迪利单抗联合西达本胺、来那度胺。
2021年10月，患者因疾病进展死亡。
原代NK-NJ细胞在患者外周血中分离，在实验室经过连续6个月的培养，获得NK-NJ细胞系（图1A）；NK-NJ细胞在悬浮液中显示出与GM12878细胞系相似的聚集生长模式（图1B）；在完全培养基中的细胞倍增时间为48小时（图1C）；通过迈格吉染色法（MGG）分析细胞形态，发现NK-NJ细胞形态与间变性大细胞淋巴瘤（ALCL）细胞类似（图1D）。
流式细胞术（FCM）分析发现，NK-NJ细胞系和患者原代肿瘤细胞的免疫表型一致，证明NK-NJ细胞系来源于患者，并且两者均无TCR基因重排，因此肿瘤细胞起源于NK细胞谱系而不是T细胞谱系。细胞遗传学分析表明NK-NJ细胞系与患者原代肿瘤细胞核型特征基本相同，再次证明NK-NJ细胞系来源于患者（图1E）。此外，短串联重复（STR）分析结果也表明NK-NJ细胞系来源于患者。
图1. NK-NJ细胞系特征
世和血默胜™大Panel揭示患者疾病进展过程中的克隆演化，NK-NJ细胞系WES测序揭示染色体的不稳定性
对诊断时鼻部病灶、第一次淋巴结进展的腹股沟病灶和血浆标本、第二次进展的PBMC样本进行世和血默胜™大Panel测序，发现首次疾病进展的主要突变基因与鼻部原发病灶相同，但是仅在第一次进展时的血浆和第二次进展时的PBMC样本中检测到STAT5B突变，提示疾病进展过程中出现克隆演化（图2A）。
此外，对NK-NJ细胞系进行全外显子测序（WES），体细胞拷贝数变异（CNV）分析结果显示，该细胞系是四倍体，并揭示了该细胞系基因组染色体臂的扩增和缺失，包括7q、8q、19p/q、21q的扩增和4p/q、7p、11q、18p/q的缺失（图2B，2C），且这些染色体臂区域发生拷贝数变异的占比非常高，大部分超过95%，这也表明该细胞系染色体的不稳定性（图2D）。
图2 患者治疗过程中的克隆演化与NK-NJ细胞系的基因组特征
全转录组测序（RNAseq）揭示NK-NJ细胞系为EBV潜伏I型，且携带高水平的EBV病毒
通过对患者EBV病毒潜伏感染基因和裂解感染基因的均一化mRNA表达水平分析发现，患者仅在诊断时、第一次疾病进展和第二次疾病进展时出现潜伏基因EBER1的高表达和裂解基因（A73、RPMS1、LF1、LF2、BALF1、BALF3、BALF4、BALF5）相对高水平表达（图3A）。
此外，潜伏I型细胞系（RAJI和DAUDI）和潜伏III型细胞系（GM12878和FARAGE）的EBNA2、LAMP1、LMP1P、CP、WP、QP基因启动子表达水平分析表明，NK-NJ细胞系为潜伏I型，且仅为EBER阳性（图3 B-G）。通过EBV DNA拷贝数分析发现，与FARAGE， GM12878， RAJI， DAUDI 4株 EBV阳性细胞系对比，NK-NJ细胞系携带高水平的EBV病毒载量（图3 H-J）。
图3. NK-NJ细胞系的EBV潜伏感染模式
NK-NJ细胞系药物分析发现ENKTL潜在获益药物
尽管I/II期ENKTL患者可以从基于培门冬酶的治疗方案中获得良好的长期疗效，但晚期（III/IV期）ENKTL患者对基于培门冬酶的治疗方案反应不佳，1年OS较低。
该研究探究了NK-NJ细胞系对几种潜在药物（XPO1抑制剂-塞利尼索、BTK抑制剂-伊布替尼、bcl2抑制剂-维奈克拉、JAK抑制剂-芦可替尼、CDK抑制剂-帕博西尼和去甲基化药物-阿扎胞苷）的半抑制浓度（IC50），结果发现XPO1抑制剂可能对进展期或R/R ENKTL有效（图4A）。正常的外周血CD19+ B细胞表达低水平的PD-L1，感染EB病毒后，PD-L1的转录水平和蛋白水平均上调（图4B，4C）。
在此基础上，研究者进一步使用地西他滨和阿扎胞苷来诱导免疫性EB病毒抗原的表达，随着药物浓度的增加，PD-L1转录和蛋白质的水平逐渐增加，表明阿扎胞苷联合PD-1抑制剂可能增加抗肿瘤活性（图4D，4E）。
图4. NK-NJ细胞系潜在靶向药物分析
结语
本研究构建了一例R/R鼻型ENKTL患者PBMC分离的NK-NJ细胞系模型，通过NGS技术（靶向NGS，WES和RNA-seq）全面揭示疾病进展时的克隆进化机制及NK-NJ细胞系的基因组特征和EBV感染特征，最后通过药物分析发现进展期或R/R ENKTL的潜在获益药物，为进展期及R/R ENKTL未来诊疗方案奠定理论基础。
参考文献
[1] Liang JH, Wang WT, Du KX, Xing TY, Wang Y, Wang H, Liu L, Guo R, Shao Y, Liang J, Li Y, Shen HR, Wang L, Li JY, Xu W. Establishment and comprehensive analysis of a new human cell line (NK-NJ) with NK-cell characteristics established from extranodal natural killer cell lymphoma/leukemia. Hum Cell. 2022 Dec 15. doi: 10.1007/s13577-022-00841-y. Epub ahead of print. PMID: 36520345.
作者：青藤 审核：Martian 排版：Moro
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