随着肿瘤临床诊疗的高速发展，高通量测序的临床应用也不断被赋予新的使命。自2016年《“健康中国2030”规划纲要》发布以来，“健康中国”上升为国家战略，在坚持预防为主、防治结合的原则指导下，人民的健康意识逐步加强，近年来越来越多的肿瘤在早中期被确诊。今年5月10日，国家发展改革委发布的《“十四五”生物经济发展规划》中也将“早筛与精准用药”纳入其中，再次强调肿瘤早筛查、早诊断、早治疗的战略意义。在健康规划重心引导、健康理念普及，和临床需求的共同推动之下，肿瘤防治的关口逐渐前移至围术期监控、复发监控及早筛早诊等领域，对第三方检测公司的需求也不断更新，早中期肿瘤分子诊断的研发布局成为检测公司未来市场竞争力的关键。 世和基因致力于NGS临床转化，除了全面覆盖肿瘤用药靶点、持续优化并探索新靶点、新分子标志物，为晚期肿瘤患者提供个体化精准治疗方案外，在早中期肿瘤的临床应用方面，也通过对ctDNA液体活检的研发布局展开，主要体现在两大方向：术后微小/分子残留病灶MRD监测和肿瘤早筛早诊。2021年至今，世和基因在这两个方向的研究成果已在 Molecular Cancer，Journal of Hematology & Oncology, Nature Communications 等国际权威期刊发表八篇文章，影响因子达到187分。下面小编就带大家温习一下MRD监测的技术要点难点，并一起回顾相关文献数据。
术后微小/分子残留病灶MRD监测
肿瘤患者在治疗中或治疗后体内仍有残留的恶性肿瘤细胞存在，成为微小残留病灶（Minimal Residual Disease，MRD）或分子残留病灶（Molecular Residual Disease），是肿瘤根治术后复发的主要原因之一。术后残留的肿瘤细胞会不断向血液循环释放ctDNA，因此可以通过ctDNA来监测肿瘤信号，评估患者术后MRD状态。国内外已有多项研究证明，基于ctDNA液体活检技术可优于传统影像学方法预测肿瘤复发，且样本采集非侵入性，可为临床决策争取重要的时间窗口。
目前NGS-MRD的检测技术主要划分为两大流派：(1) Tumor-informed assays，即针对原发肿瘤组织中一定数量的突变位点设计定制Panel进行后续的ctDNA检测。(2) Tumor-naïve assays，不依赖于原发肿瘤组织，通过预先设计的与癌种相关的固定化Panel进行ctDNA检测[1]。其核心技术依赖超高灵敏度测序，利用分子标签对背景噪音进行抛光处理，并排除克隆性造血干扰，提高单个位点灵敏度， 捕捉早中期肿瘤ctDNA的低丰度信号。
图1. Tumor-naïve assays（左）及Tumor-informed assays（右）示意图[2]
两种流派分别受到不同检测公司的青睐，两者各有所长，一时之间难分伯仲，引起行业内和临床专家的广泛讨论。Tumor-informed assays的主要优势在于可以根据患者肿瘤定制个体化Panel监测的突变数量，监测16个或更多的突变，避免因不同个体之间差异带来的测序浪费，相应的，检测本身的成本也更低。而Tumor-naïve assay的优势则主要体现在以下几个方面[1]：
1 ► 克服肿瘤时空异质性：
由于肿瘤的异质性和克隆进化，某一时刻的部分肿瘤组织可能无法反映肿瘤整体、其他潜在病灶以及肿瘤未来的变化情况。Tumor-naïve assay不依赖肿瘤组织，可以更广泛地进行覆盖和监测，克服时空异质性。同时，固定化Panel监测的突变数量更多，灵敏度也会提高。
2 ► 待监测基因在肿瘤中的角色明确：
固定化Panel重点关注癌种相关的驱动基因及与肿瘤发生发展密切相关的基因。而个体化Panel一般通过WES对肿瘤组织进行测序，可能会检测与肿瘤发展关系未知的陌生基因，给个体化Panel带来一定的不确定性，需要进一步筛选和优化。
3 ► 稳定的Panel质控：
成熟的固定化Panel可以省去每次定制过程中的探针设计、探针合成、探针库优化、性能验证等环节，避免个性化监测位点组合之后的探针均一性等质控问题，确保检测性能的稳定性和结果的可靠性。
综合考量两种技术的优劣之后，世和基因在MRD监测Panel的选择更偏向tumor-naïve路线，根据中国人群的肿瘤特征来选择固定的监测Panel。但更为重要的是，流派之间的伯仲之争不能纸上谈兵，囿于理论和实验室技术性能。一项技术能否为患者带来福音，最终还要依赖于足够的临床验证。虽然国内MRD检测产品百家争鸣，临床医生的优先考虑仍然是经过临床性能验证且有相应重磅科研成果发表的检测产品。世和早在2016年就开始启动CALIBRATE系列围术期MRD监测临床研究，2021年5月以来，四项成果已陆续在影响因子>10分的期刊上发表：
CALIBRATE系列围术期MRD监测研究
CALIBRATE-NSCLC研究(Nature Communications IF=17.7) [3] (点击详情) ，与中国医学科学院肿瘤医院高树庚教授团队合作开展, 是国内首个前瞻性肺癌MRD临床研究。入组了116例非小细胞肺癌患者，对术后1个月内血浆样本进行超高灵敏度的NGS液体活检，其中术后MRD阳性，与MRD阴性患者相比，复发风险显著升高，是患者术后DFS的独立预测因素。术后MRD状态也与辅助治疗获益程度密切相关，术后MRD阳性患者可能能从辅助治疗中获益，而阴性患者辅助治疗获益不显著。该研究更是通过ctDNA动态变化情况建立了监测模型，更精准地根据肿瘤的变化情况提示复发。
图2. 根据ctDNA状态计算进行个性化动态风险预测，并在新检测可用时进行更新[3]
CALIBRATE-CRC研究 (Journal of Hematology & Oncology，IF=23.2) [4] (点击详情) ，与中山大学肿瘤防治中心徐瑞华教授团队联合复旦大学附属肿瘤医院蔡三军教授团队、浙江大学第二附属医院丁克峰教授团队合作开展，是前瞻性多中心队列研究（NCT03312374），也是国内首个大型肠癌ctDNA MRD前瞻性临床研究，中位随访时间超过2年，收集了超2000份样本。研究发现，术后3-7天MRD阳性是可以预测肠癌复发的独立指标，辅助治疗后的MRD状态也可以显著提示复发风险，ctDNA动态监测可以早于影像学5个月提示复发。
图3. (a) 术后血ctDNA MRD阳性的患者，复发风险显著高于阴性患者，HR=10.98;
(b) 辅助治疗后ctDNA MRD阳性的患者，复发风险显著高于阴性患者，HR= 12.76；
(c) 动态监测过程中评估为ctDNA MRD阳性患者，复发风险显著高于阴性患者，HR=32.02；
（d）ctDNA动态监测相比于影像学检测能够更早提示肿瘤复发，中位提前时间为5.01个月[4]
CALIBRATE-RC-nCR 研究(PLOS Medicine，IF=11.6) [5] (点击详情)，与复旦大学附属肿瘤医院章真教授团队合作开展，研究对象为接受新辅助放化疗(nCRT)的局晚期直肠癌(LARC)患者，共入组119例，通过连续ctDNA动态监测精准预测直肠癌新辅助放化疗病理完全缓解(pCR) 的情况，并与病理特征结合对LARC患者进行分层，为后续个性化管理提供有效手段。
图4. 五种ctDNA特征，联合mrTRG信息的pCR多特征预测模型可更准确地指导watch-and-wait患者群筛选[5]
CALIBRATE-LC/EC-CRT研究（Molecular Cancer，IF=41.4）[6](点击详情)，与中国医学科学院肿瘤医院王绿化教授、毕楠教授团队合作开展。前瞻性地对接受根治性放化疗的NSCLC患者进行多个时间点的ctDNA动态监测，发现患者接受治疗后各个监测时间点ctDNA状态均能在一定程度上预测患者预后，其中RT/CRT后一个月预测结果最好，且ctDNA动态变化也与临床结果密切相关。
图5. 研究设计（上）/ 术后一个月ctDNA状态预测患者预后情况（下）[6]
结语
肿瘤的早筛查、早诊断、早治疗事业方兴未艾，越来越多的市场资源和研发力量加入其中，为技术和行业发展源源不断地提供着新鲜血液。世和基因在术后MRD监测和早筛方面抢先进行战略布局，大量的研发投入已逐步得到临床数据的验证以及临床专家的认可。但在未来，无论是开展基于术后MRD状态的干预性研究，还是早筛的广泛市场推广所需的大规模人群研究，对企业的技术研发、资源调配、临床管理能力都将是不小的挑战。世和基因已做好万全的准备迎接挑战，继续在技术的深度和广度上不断拓宽，踏浪前行。
参考文献
1、深度分享 | 国内NGS-MRD检测技术流派之争：个体化Panel or 固定化Panel？https://mp.weixin.qq.com/s/iZLRt0YHrmkON-2saCT5dA
2、Webinar #3: Opportunities and Challenges Toward the Clinical Application of ctDNA MRD Testing in Solid Cancers. Speaker: Everett Moding, MD PhD. Date: Tuesday September 28, 2021 at 2:00pm Eastern. Meeting: Utility of Cell-free DNA in the Clinic: Current State and Future Directions
3、CALIBRATE-NSCLC: Qiu et al. Dynamic recurrence risk and adjuvant chemotherapy benefit prediction by ctDNA in resected NSCLC. Nat Commun. 2021 Nov 19;12(1):6770.
4、CALIBRATE-CRC: Chen et al. Postoperative circulating tumor DNA as markers of recurrence risk in stages II to III colorectal cancer. J Hematol Oncol. 2021 May 17;14(1):80.
5、CALIBRATE-RC-nCR: Wang et al. Utility of ctDNA in predicting response to neoadjuvant chemoradiotherapy and prognosis assessment in locally advanced rectal cancer: A prospective cohort study. PLoS Med. 2021 Aug 31;18(8):e1003741..
6、CALIBRATE-LC/EC-CRT：Yang, Y., Zhang, T., Wang, J. et al. The clinical utility of dynamic ctDNA monitoring in inoperable localized NSCLC patients. Mol Cancer 21, 117 (2022).
