导  读

ToGA研究已经证实,曲妥珠单抗联合化疗可显著延长HER2+转移性胃癌(mGC)患者的总生存期,但由于胃癌具有高度的异质性,曲妥珠单抗用于胃癌治疗存在疗效有限和快速耐药的问题。因此需要明确曲妥珠单抗的原发和继发耐药机制,以筛选曲妥珠单抗响应人群和寻找克服耐药的治疗方案。近期,中山大学附属肿瘤医院徐瑞华院长团队的一项研究,应用世和基因全景416基因泛实体瘤NGS检测panel对78例胃癌患者相匹配的组织和血浆ctDNA样本进行靶向深度测序,并对24例HER2+ mGC患者曲妥珠单抗联合化疗治疗期间进行动态监测,全面探究胃癌曲妥珠单抗耐药机制,为耐药后下一步治疗方案调整提供有效线索,成果已被胃肠道肿瘤领域国际顶级期刊GUT(IF=17.016)接收。

正  文

研究发现416基因靶向深度测序HER2基因拷贝数变异(SCNA)检测结果与FISH检测结果高度一致,且HER2 SCNA动态监测比CEA能更好的预测肿瘤退缩或进展,表明基于NGS的液态活检能够预测曲妥珠单抗的治疗疗效。进一步的研究还发现大多数对曲妥珠单抗原发耐药的患者在疾病进展后展现出更高的HER2 SCNA,而获得性耐药患者HER2 SCNA相对基线明显下降。PIK3CA基因突变在曲妥珠单抗原发耐药患者中显著富集,在部分曲妥珠单抗耐药患者的基线和进展后的血浆ctDNA中可检测到ERBB2/4基因突变。基线血浆中PIK3CA/R1/C3突变和ERBB2/4基因突变与更差的PFS显著相关。此外,本研究通过in vitro和in vivo研究证实了NF1基因突变可导致曲妥珠单抗耐药,且HER2和MEK/ERK双重阻断可克服NF1突变导致的曲妥珠单抗耐药。本研究的一序列研究成果表明持续的ctDNA动态监测可监测曲妥珠单抗耐药的发生,揭示潜在的耐药机制,并为下一步治疗方案的调整提供有用的线索。

(1)应用NGS检测组织/血浆中HER2基因扩增与组织FISH检测结果的一致性研究

本研究纳入78例胃癌患者,分别收集组织样本和匹配的血浆样本进行416基因靶向深度测序,以评估两者之间的一致性。研究发现组织样本和血浆样本突变图谱具有高度一致性,ERBB2和TP53基因变异在组织和血浆样本中均为突变频率最高的两个基因。但二者之间也存在明显的异质性,比如54例(69.23%)组织样本和58例(74.36%)血浆样本中检测到HER2基因扩增,其中41例患者的组织与血浆样本中均检测到HER2基因扩增(图1)。在突变检测方面,组织样本可检测出更多的突变,但组织和血浆中突变数量具有高度相关性(R=0.89)。54例(69.23%)组织样本和22例(28.21%)血浆样本中检测到TP53突变,其中21例患者的组织和血浆样本中均检测到TP53突变。总体来说,血浆ctDNA突变图谱可以较好反映肿瘤组织中突变状态,特别是晚期肿瘤。

HER2基因扩增是HER2+GC重要的分子标记物,本研究比较了组织、血浆NGS测序与组织FISH检测HER2基因扩增的一致性。78例匹配的患者中,23例为HER2+++,23例为HER2++/FISH+。FISH检测判定扩增的患者其组织和血浆NGS检测HER2基因的拷贝数均明显高于FISH检测非扩增组,且NGS检测组织和血浆中HER2拷贝数显著相关(R=0.39,P=0.0039)。进一步用NGS预测FISH HER2扩增的检测结果,发现基于NGS的拷贝数变异检测可较好的展示HER2基因扩增,其组织和血浆检测的AUC值分别达到0.8764和0.7317,这也表明基于血浆ctDNA的HER2基因扩增检测可为HER2+ GC患者肿瘤提供新线索。

图1. 78例mGC患者配对组织和血浆样本高频基因突变图谱

(2)基于ctDNA动态监测揭示曲妥珠单抗耐药机制以及预测曲妥珠单抗治疗疗效的研究

本研究对24例接受曲妥珠单抗联合化疗治疗的HER2+ mGC患者进行了ctDNA动态监测,共计检测97个血浆样本。其中14例患者为获得性耐药(PFS>3个月),3例患者为原发耐药(PFS<3个月),还有7例患者正在治疗中。研究发现血浆ctDNA中HER2 SCNA和突变的动态变化与肿瘤负荷高度相关,并且比CEA能更好的预测肿瘤的退缩(图2A)。肿瘤的耐药与其异质性密切相关,靶向治疗中HER2扩增的亚克隆会优先被曲妥珠单抗结合,因此研究者分析了从治疗开始至肿瘤进展过程中潜在的曲妥珠单抗耐药克隆(图2B)。在17例进展的患者中,10例(59%)患者在基线和PD时均检测到HER2扩增,这10例患者的耐药克隆可能已经从HER2基因扩增转变为其他能够抵抗曲妥珠单抗治疗的变异。另外4例患者仅基线检测到HER2扩增,PD时未检测到HER2扩增,这个结果提示HER2扩增的克隆群可能在曲妥珠单抗治疗过程中消失,而其他非HER2扩增克隆导致曲妥珠单抗耐药。还有1例(6%)患者基线未检测到HER2扩增但PD时检测到,且治疗中同时检测到MET和STAT3基因扩增,表明曲妥珠单抗的耐药机制非常复杂。总的来说,本研究观察到患者治疗期间HER2基因拷贝数较基线和PD时显著下降(P<0.05),提示曲妥珠单抗可以有效杀死HER2扩增型克隆(图2C)。3例原发耐药患者PD时HER2拷贝数高于基线,而14例获得性耐药的患者PD时HER2拷贝数低于基线(p=0.0591)(图2D)。

图2. (A)肿瘤负荷与CEA、HER2 SCNA、突变负荷等指标一致性分析;(B)肿瘤进展相关曲妥珠单抗潜在耐药性克隆分布;(C)基线、治疗期间和PD时HER2基因拷贝数差异分析;(D)基线和PD时HER2基因拷贝数对比分析

已有一些研究报道FGFR(s), MET, MYC, STAT3, PI3K(s), ARID1A, AXL, ATM, mTOR/TSC2和SRC可能与曲妥珠单抗耐药相关。与以往研究类似,本研究也在患者曲妥珠单抗治疗期间检测到与曲妥珠单抗耐药相关的分子改变或突变丰度的升高(图3A)。在13例(76.5%)患者中,这些基因的分子改变在曲妥珠单抗治疗期间产生或者丰度升高,可能与曲妥珠单抗耐药相关(图3B)。HER2突变是最常见的耐药机制,在4例患者的基线和PD时的血浆ctDNA中均检测到HER2突变(图3A);2例患者ERBB2和PIK3CA/R1/C3均发生突变;3例患者基线和2例患者PD时检测到ERBB4激活突变;另外2例患者基线检测到STAT3扩增,其中1例患者PD后还检测到MET基因扩增。总体来说ERBB2扩增、ERBB2/4突变以及PIK3CA/R1/C3突变是发生频率最高与曲妥珠单抗耐药相关的基因变异(图3C)。值得注意的是,3例曲妥珠单抗原发耐药患者中,2例(66.7%)检测到PIK3CA突变,提示曲妥珠单抗治疗前PIK3CA的突变检测可能鉴别出该药物的原发耐药患者。

图3. (A)基线和PD时已知的曲妥珠单抗耐药相关基因变异图谱;(B)曲妥珠单抗潜在耐药性机制概述;(C) ERBB2/4和PIK3CA/R1/ C3基因变异检测结果

PIK3CA/R1/C3 和 ERBB2/4 是与曲妥珠单抗耐药相关的最常见分子变异,研究者对这几个基因的突变位点进行了深入分析。其中2例原发耐药患者分别检测到PIK3CA R88Q和E545K突变,已有文献报道这两个突变均可激活PIK3CA;1例患者检测到PIK3CA E542K,研究截止时尚未PD,关于E542K的功能目前尚未见文献报道;2例获得性耐药患者分别检测到PIK3R1 N707S 和PIK3C3 T488A突变,同样功能未知(图4A)。总的来说有4例患者至少检测到1个PIK3CA/R1/C3突变,基线检测到PIK3CA/R1/C3突变的患者较野生型患者PFS更差(mPFS,2.257 vs 10.667;p<0.0001)(图4B)。

在6例患者的基线血浆中共检测到6个与曲妥珠单抗耐药相关ERBB2/4突变,分别为S310F, F364Y, R678Q 和V842I,其中S310F和V842I已有文献报道为激活突变(图4C)。ERBB2/4突变与野生型相比有更差的PFS(mPFS,5.433 和 10.667;p=0.041)(图4D)。2例患者中检测到ERBB4 K1207R 和 W957L突变,与野生型相比,ERBB4突变型患者PFS更差(图4E),这也表明ERBB4 K1207R和W957 突变与曲妥珠单抗的耐药密切相关。有意思的是,1例患者基线检测到ERBB4 S774G突变但治疗过程中该突变消失,这例患者较ERBB4野生型患者获得更长的PFS,并显著长于ERBB4 K1207R 和 W957L突变的患者。因此,研究者猜想ERBB4 S774G为曲妥珠单抗敏感性突变,并通过细胞系实验证实ERBB4 S774G变异的HER2+细胞系比不携带该突变的细胞系对曲妥珠单抗更加敏感(图4F)。

图4. (A)PIK3CA/R1/C3突变分布;(B)PIK3CA/R1/C3突变患者曲妥珠单抗治疗无进展生存曲线;(C) ERBB2/4突变分布;(D)ERBB2/4突变患者无进展生存曲线;(E) ERBB4突变分布;(F)ERBB4 S774G突变HER2+细胞系对曲妥珠单抗敏感性增加(10,20,40ug/ml,p<0.05)

(3)体外和体内实验证实NF1基因突变是曲妥珠单抗治疗新的耐药机制

本研究除了分析已报道的与曲妥珠单抗耐药相关的基因,还探究了其他可能导致曲妥珠单抗耐药的基因突变。研究者在至少2例患者PD时检出NF1, BAP1, CSF1R, GNAS和THADA突变。以往研究表明NF1缺失在皮肤黑色素瘤中非常常见,且跟RAF抑制剂的耐药相关。本研究在2例患者中检测到两个不同的曲妥珠单抗耐药相关的NF1基因突变,提示NF1可能是一个新的耐药机制。其中在一例患者(AR1)中检测到NF1 E217X突变,该突变在患者治疗过程中突变丰度与主克隆相比升高;另一例患者(AR14)在PD时检测到NF1 A3T突变。AR1患者治疗前检测到NF1、CSF1R、CDK12、TET2、ERBB2和ERBB4激活突变,且在治疗中克隆增加。AR14患者中携带MAP2K4的亚克隆初始消失但随后又重新出现,而PIK3R1和NF1突变随时间变化。患者进展时AR1和AR14患者ctDNA中NF1基因突变型肿瘤细胞DNA片段(cancer cell fractions ,CCF)分别为17.1%和7.5%,ddPCR确认AR1患者ctDNA中NF1 E217X 突变型等位基因频率为1.42%,而AR14患者中A3T突变型接近ddPCR的检出线。ddPCR的结果证实了这两例患者的NF1突变真实存在。

为了验证NF1的功能,研究者采用shRNA构建NF1基因位点沉默细胞系(shRNA,#1和#2)以及非沉默的scrambled shRNA(shSC)作为阴性对照,并将shRNA分别转染到NCI-N87和SNU-216细胞系中。MTS分析发现NF1靶向shRNA载体降低了对HER2抑制剂的敏感性,表明NF1基因沉默可介导NCI-N87和SNU-216细胞系对HER2抑制剂耐药。体外试验证实NF1缺失可解除MEK/ERK激活的负反馈,导致MEK/ERK激活升高,进而使得抗HER2治疗出现耐药(图5A),并且拉帕替尼也不能完全抑制NF-1水平下降后RAS-ERK信号通路的激活。基于以上发现,研究者猜想HER2和MEK/ERK双重阻断可能克服NF1失活导致的抗HER2治疗耐药(图5B)。进一步体外实验证实拉帕替尼和司美替尼联合治疗NF1-/HER2+的细胞,司美替尼的敏感性和下游信号通路的抑制得以重新恢复(图5C-D)。这些结果表明HER2和MEK/ERK双重阻断可显著抑制NF1-/HER2+细胞活性。为了证实该方案的可行性,研究者还进行了深入的体内研究,证实在NF1敲除的小鼠中,使用拉帕替尼和MEK/ERK抑制剂司美替尼双重阻断的联合用药方案可有效抑制HER2阳性肿瘤的生长(图6A),但单独的拉帕替尼对NF1敲除的HER2+小鼠无效,而司美替尼可中度抑制NF1敲除的HER2+小鼠肿瘤的生长(图6B-C)。综上数据表明,联用MEK/ERK抑制剂可使HER2+GC中NF1低表达肿瘤再次对抗HER2治疗敏感。

图5.(A)NF1下调激活MAPK信号通路;(B)HER2和ERK双重阻断作用于NF1突变的HER2+GC的示意图;(C)和(D)NF1-silenced NCI-N87 (C) 和 SUN-216(D)细胞系对HER2和MEK/ERK双重阻断更加敏感

 

图6. (A) 拉帕替尼+司美替尼在SNU-216-NC和SNU-216-sh#NF1移植裸鼠异种移植模型中的治疗效果;(B)拉帕替尼+司美替尼联合治疗25天有效降低NF1沉默组和对照组肿瘤的生长;(C) NF1敲除肿瘤对抗拉帕替尼耐药,对司美替尼有一定程度响应

结  语

胃癌是一种具有高度异质性的肿瘤,血浆ctDNA检测可提供更多的基因组变异信息。本研究首次证明了基于NGS的ctDNA液态活检是监测曲妥珠单抗耐药并发现HER2+ GC新的耐药机制的有效方法,而且HER2 SCNV动态监测较CEA能更好的预测曲妥珠单抗的治疗疗效。同时,本研究首次提出了基于ctDNA检测的 HER2基因拷贝数变化与HER2+ GC曲妥珠单抗治疗的耐药机制相关,并鉴定出一序列曲妥珠单抗耐药机制,发现PIK3CA/R1/C3和ERBB2/4突变的患者曲妥珠单抗治疗时显示出更短的PFS,而ERBB4 S774G则与更长PFS相关。此外,本研究还首次报道了HER2+ GC中曲妥珠单抗治疗耐药后出现NF1突变的情况,发现NF1突变是曲妥珠单抗新的耐药机制,并通过体外和体内实验证实HER2和MEK/ERK双重阻断可克服NF1失活导致的曲妥珠单抗耐药。总之,虽然ctDNA检测存在一些局限性,但是基于NGS的ctDNA液态活检可无创分析曲妥珠单抗耐药患者的分子图谱和曲妥珠单抗的耐药模式。ctDNA动态监测分析原发耐药和继发耐药机制,也将不断深化针对肿瘤异质性和肿瘤克隆演化相关耐药的个体化医疗的应用,更好地为临床医生和患者提供精准治疗指导!

世和基因一直秉持着“科学为先,患者至上”的世和精神,与来自全国各地的肿瘤专家开展广泛的临床研究并不断有新的研究成果发表。立足过去,掌握现在,展望未来,世和基因期待与更多的学者专家能开展癌症领域临床科学研究,促进肿瘤精准医学的不断进步,在临床服务和科学研究双方面再攀高峰,更上一层楼!

参考文献

Wang DS, Liu ZX, Lu YX, Bao H, Wu X,Zeng ZL, Liu ZK, Zhao Q, He CY, Lu JH, Wang ZQ, Qiu MZ, Wang F, Wang FH, Li YH,Wang XN, Shao Y, Xu RH. Liquid biopsies to track trastuzumab resistance inmetastatic HER2-positive gastric cancer. Gut. 2018 Sep 29.